УДК 616.5–002.525.2–039.54–097

ВСТУП

Антиядерні антитіла (antinuclear antibody — ANA) є основними діагностичними маркерами системного червоного вовчака (CЧВ), оскільки при цьому захворюванні їх виявляються у 95% пацієнтів. Скринінгові тести при СЧВ — це виявлення АNА та антитіл до двоспіральної дезоксирибонуклеїнової кислоти (аntibodies to double-stranded deoxyribonucleic acid — anti-dsDNA). Для остаточного встановлення діагнозу використовують підтверджуючі тести, основою яких є аутоантитіла до екстрагованих ядерних антигенів (аutoantibodies to extracted nuclear antigens — аntі-ENA), які складаються із комплексів розчинних рибонуклеопротеїнів. Аntі-ENA часто виникають до двох груп мішеней: 1) специфічного рибонуклеїнового комплексу (RNP) — Ro/La частинок; 2) U1RNP-комплексу. U1RNP-комплекс (антитіла до білкових компонентів U1 малого ядерного рибонуклеопротеїду — U1RNA) — це більший компонент сплайсосоми, котрий каталізує pre-miRNA (клас RNA, при розчепленні якого на дві частини з однієї утворюється miRNA) [9]. Для цього комплексу характерна присутність аутоантигенів, що cкладаються з RNP білків (RNP70, RNP А, RNP В, RNP С) та Sm-антигену, названого на честь хворого Smith, у якого він був вперше виявлений; цей антиген складається із п’яти малих ядерних RNA (U1, U2, U4, U5, U6), асоційованих з ≥11 поліпептидів (Аʹ, Вʹ/Вʹ, С, D, E, F, G) [10]. Ro/La комплекс складається з чотирьох малих уридин-збагачених, цитоплазматичних RNA частинок (hYRNA) та декількох асоційованих протеїнів Ro60, Ro52, La/SS-B. Обидва Ro60 та La/SS-B антигени володіють RNA-зв’язуючими властивостями; вони можуть зв’язувати RNA як напряму, так і опосередковано через асоціацію з Ro52 [5, 10]. Anti-Sm, anti-RNP, anti-Ro/La антитіла асоціюють із СЧВ, відповідно з частотою 20–30; 30–40 та 40% випадків. Незважаючи на чіткі клінічні асоціації з екстрагованими ядерними аутоантигенами (ЕNA), необхідно врахувати, що anti-ЕNА ефективніші для діагностики СЧВ, а не для оцінки активності хвороби чи пошкодження органів [4]. Варто зазначити, що частота аnti-Sm у хворих на СЧВ коливається залежно від етнічної групи: від 10% у кавказьких народів (грузини, вірмени, азербайджанці, осетини, абхазці) до 35–40% у європейців [12]. У пацієнтів із СЧВ, в яких дебют хвороби припав на вік старше 50 років, відзначають нижчу частоту anti-RNP та Sm-антигену порівняно з хворими на СЧВ, маніфестація якого почалася у молодому віці [6]. За даними когортного дослідження СЧВ, високі рівні anti-Ro, anti-La спостерігалися у хворих на СЧВ з ураженням нервової системи [7]. E. Ahlin та співавтори (2012) визначили, що група антитіл до RNA (anti-RNP/Sm, anti-Sm, anti-SS-A/Ro60, anti-SS-A/Ro52, anti-SS-B/La) частіше входять до складу циркулюючих імунних комплексів, ніж DNA-aсоційовані (anti-dsDNA, антигістонові, антинуклеосомні) або цитоплазматичні (антирибосомні Р) антитіла [5].

Мета роботи — вивчити взаємозв’язки аутоантитіл аntі-ENA зі скринінговими аутоантитілами у пацієнтів із СЧВ.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Проаналізовано результати обстеження 105 хворих на СЧВ віком від 17 до 68 років (у середньому — 34±0,8 року). Серед цих пацієнтів були 14 (13,3%) чоловіків та 91 (86,7%) жінка. Тривалість маніфестації хвороби становила 5±0,5 року. Гострий перебіг патологічного процесу був у 7 (6,6%), підгострий — у 23 (21,9%), хронічний — у 75 (71,5%) хворих. Мінімальний ступінь активності хвороби був у 17 (16,2%) пацієнтів, помірний — у 65 (61,9%), високий — у 23 (21,9%).

Визначення anti-dsDNA. Кількісне визначення аутоантитіл класу IgG до двоспіральної ДНК (dsDNA) проводили методом хемілюмінесцентного імуно­аналізу (CLIA) за допомогою аналізатора LIAISON. Для дослідження використовували тест-системи фірми «DiaSorin» (Італія) [5, 6].

Синтетична dsDNA зв’язана з магнітними мікрочастинками, мишачі моноклональні антитіла до людського IgG мічені похідними ізолюмінолу (кон’югат антитіл з барвником). Під час першої інкубації антитіла до dsDNA, присутні у калібраторах, контролях та пробах, зв’язуються з твердою фазою. Під час другої інкубації кон’югат взаємодіє з IgG до dsDNA, вже фіксованим на твердій фазі. Після кожної інкубації незв’язані молекули видаляються під час циклу промивання. Потім до реакційної суміші додавали реактиви для активації, котрі індукують хемілюмінесцентну реакцію. Інтенсивність люмінесценції вимірювали за допомогою фотоприскорювача у відносних одиницях інтенсивності, що відображає концентрацію anti-dsDNA (IgG) в калібраторах, контролях і пробах пацієнтів у МО/мл. Вимірювальний діапазон 0,5–340 МО/мл. Норма — менше 25 МО/мл.

Визначення титру ANA. Для дослідження титру ANA використовували метод непрямої радіоімуно­флюоресценції в оригінальній модифікації з використанням як субстрату клітин лінії аденокарциноми гортані людини HEp-2. Результат досліджували за допомогою люмінесцентного мікроскопа. Для дослідження використовували реактиви фірми «ImmunoConcepts» (СШA) [1].

У лунки з моношаром культури клітин HEp-2 вносили сироватку хворих у розведенні 1:80. Відмивання проводили у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) впродовж 10 хв. Для виявлення утворених імунних комплексів використовували 30-хвилинну інкубацію сироваткою кроля проти IgG людини, міченої флюоресцеїнізотіоціанатом. Після відмивки ФСБ впродовж 10 хв зрізи переміщували в гліцерин, забуференний ФСБ (10:1; рН 8,2). При виявленні у хворого АNA описували тип світіння та визначали кінцевий титр антитіл. Для стандартизації цього методу використовували референтну сироватку ВООЗ AF/CDC1, котра містить 100 МО/мл з гомогенним типом ядра, що відповідає нормі розведення сироватки до 1:160.

Визначення АNA-скринінгу. Для проведення скринінгового кількісного визначення АNA методом імуноферментного аналізу (ІФА) використовували реактиви фірми «ORGENTEC» (Німеччина). Для дослідження використовували тест-системи фірми «DiaSorin» (Італія). Цей метод загалом визначає АNA й антитіла проти SS-A/Ro, SS-B/La, RNP/Sm [6].

Ці очищені антигени додані в мікролунки. Антитіла проти цих антигенів присутні у сироватці та плазмі крові та зв’язуються у наявних зразках із відповідними антигенами. При промиванні були видалені незв’язані компоненти сироватки. Розчин кон’югантів людського IgG з пероксидазою хрону додавали в лунки для визначення аутоантитіл, зв’язаних з іммобілізованими антигенами. Дослідження відкалібровано згідно з міжнародними значеннями сироваток CDC (Атланта, США), крім того, ВООЗ для anti-DNA Wo/80. Інтерпретація результатів АNA-скринінгу: АNA — норма менше 1,0; норма рівня ENA — SS-A/Ro, SS-B/La, RNP/Sm —до 20 МО/мл.

Cтатистичну обробку матеріалу проводили з використанням пакета прикладних програм (MS Excel, SPSS), які визначали аналіз регресії та коефіцієнт кореляції Пірсона.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведено оцінку активності та тяжкості перебігу згідно з міжнародними індексами SLEDAI (Syste­mic Lupus Erythematosus Disease Acti­vity Index): немає активності — 0 балів; низька активність — 1–5 балів — 13 (12,4%); середня активність — 6–11 балів — 44 (41,9%); висока активність — 11–19 балів — 36 (34,3%); дуже висока активність — >20 балів — 12 (11,3%) хворих; та BILAG-2004 (British Isles Lupus Assessment Group): А — найбільш тяжкий ступінь активності — 20 (19,1%); В — проміжний ступінь активності — 72 (68,6%); С — легкий ступінь активності — 13 (12,4%) хворих.

АNА відповідно виявлено у 81,0% випадків, anti-dsDNA — у 86,6% хворих. Антитіла до екстрагованих ядерних антигенів визначали: anti-SS-A — у 45 хворих, з яких позитивні результати одержано у 23 (51,0%) обстежених; anti-SS-B — у 50, із них у 25 (50,0%) позитивні результати; anti-Ro-52 — у 38 хворих, із них 14 (36,8%) позитивні; anti-Sm — у 60, із них позитивні у 18 (30,0%), anti-PNP визначали у 56 пацієнтів, із них позитивні результати отримано у 18 (32,2%) хворих, що показано у табл. 1. Значущість визначення цих антитіл показана у дослідженні E. Cozzani та співавторів у 2014 р. [8].

Титри anti-RNP мали вірогідну сильну позитивну кореляційну залежність з anti-SS-А та anti-SS-B (r=0,99; p<0,01), як свідчать дані табл. 2. Найчастіше відмічали кореляцію ANA з іншими аутоантитілами при кількісному визначенні. Сильна позитивна кореляція АNA зафіксована з аутоантитілами до SS-A, SS-B та RNP, причому з аутоантитілами до SS-B вона була вірогідною (p<0,05). Подібні результати були показані у дослідженнях H.O. Yang та співавторів, котрі визначали великий епітоп аnti-Sm з амінокислотною послідовністю пептидів D183–119 у дітей з СЧВ та проводили їхню кореляцію з іншими аутоантитілами. У зазначеній роботі показано вищу чутливість (78,3% vs 26,1%, χ=25,1, р<0,05) і незначно нижчу специфічність (90,8% vs 100%, χ=13,6, р<0,05), ніж аnti-Sm. Подальший аналіз показав, що аnti-SmD183–119 позитивно корелювали з аnti-dsDNA, аnti-RNP та антигістоновими антитілами при СЧВ у дітей [13].

У табл. 2 і 3: *p<0,05 — вірогідність різниці показників.

Із використанням ІФА встановлено, що ANA, які визначали якісним методом, мали позитивну кореляцію середньої сили із anti-dsDNA (r=0,49), однак без вірогідної залежності (p>0,05). Титри аnti-dsDNA мали сильну позитивну кореляцію (r=0,72) з anti-RNP (p<0,05) та позитивну кореляцію середньої сили з аутоантитілами до SS-B та Sm-aнтигенів, причому для антитіл до Sm-aнтигенів з вірогідною різницею (p<0,05).

Аntі-ENA (SS-А, SS-B, Sm, RNP) мали позитивну кореляцію з іншими аутоантитілами та позитивно корелювали між собою. Як показано у табл. 2, anti-SS-А сильно корелювали з anti-SS-B та anti-RNP (r=0,99), вірогідно для anti-RNP (p<0,05). Аnti-SS-В аналогічно корелювали з anti-SS-А та anti-RNP. Аnti-RNP мали вірогідну (p<0,05) сильну позитивну кореляцію з SS-А та SS-B (r=0,99) і середньої сили позитивну кореляцію з аутоантитілами до Sm-антигену (r=0,54), також із вірогідною різницею (p<0,05). Аnti-Sm мали позитивну кореляцію середньої сили зі всіма аутоантитілами, окрім ANA-HEp-2, причому з вірогідною залежністю з anti-dsDNA (r=0,47) та anti-RNP (p<0,05).

Встановлено кореляцію титру аутоантитіл з індексами активності SLEDAI та BILAG. Аnti-RNP позитивно вірогідно (p<0,05) виражено корелювали із SLEDAI (r=0,57) та BILAG (r=0,60). Між собою ці індекси активності також мали вірогідну (p<0,05) сильну позитивну кореляцію (r=0,83), що свідчить про взаємозв’язок цих індексів (табл. 3).

Кореляція аутоантитіл до SS-А та SS-B з клінічними проявами СЧВ була продемонстрована у попередніх роботах авторів [3] і підтверджена у когортному дослідженні за участю 645 дітей із СЧВ, результати якого опубліковано у лютому 2017 р. [11].

Висновок

Дослідження кореляції різних аутоантитіл у хворих на СЧВ показали, що найбільша позитивна кореляція спостерігалася між ANA (ІФА, кількісне визначення) та anti-RNP, anti-SS-A, anti-SS-В (r=0,94; p<0,05). Аnti-dsDNA мали сильну позитивну кореляцію з anti-RNP (r=0,72; p<0,05) та середню позитивну кореляцію з Sm (r=0,47; p<0,05) та SS-B (r=0,67; p>0,05). Індекси активності SLEDAI (r=0,57; p<0,05) та BILAG (r=0,60; p<0,05) мали позитивну середньої сили кореляцію з anti-RNP. Вищенаведені результати демонструють позитивний діагностичний зв’язок між ANA та аnti-dsDNA з аntі-ENA (anti-RNP та anti-SS-A, anti-SS-В, anti-Sm). Активність захворювання була достовірно пов’язана тільки з anti-RNP.

Практичне значення отриманих результатів. На основі оцінки кореляції рівня аntі-ENA (anti-RNP та anti-SS-A, anti-SS-В, anti-Sm) можна прогнозувати тяжкий перебіг у хворих на СЧВ і своєчасно призначити підвищені дози імуносупресивної та протизапальної терапії для запобігання ускладненням.

Список використаної Літератури

• 1. Ляпин С.В. (2010) Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний. Пособие для врачей. СПб., 2010. 270 с.
• 2. Небильцова О.В. (ред.) (2011) Справочник по лабoраторной диагностике. Доктор Медиа, Киев. 420 с.
• 3. Толстяк Я.Ф. (2013) Зв’язок аутоантитіл з клінічними проявами та індексами активності у хворих на системний червоний вовчак. XVII Міжнародний конгрес студентів та молодих вчених, Тернопіль, 22–24 квітня. С. 214.
• 4. Agarwal S., Harper J., Kiely P.D. (2009) Concentration of antibodies to extract able nuclear antigens and disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus, 18: 407–412.
• 5. Ahlin E., Mathsson L., Eloranta M.L. (2012) Autoantibodies associated with RNA are more enriched than anti-dsdNA antibodies in circulating immune complexes in SLE. Lupus, 21: 586–595.
• 6. Barland P., Lipstein E. (1996) Selection and use of laboratory testin therheumatic diseases. Am. J. Med., 100: 16–23.
• 7. Borowoy A.M., Pope J.E., Silveman E. (2012) Neuropsychiatric lupus: the prevalence and autoanibidy associations depend on the definition: results from the 1000 faces of lupus cohort. Semin. Arthritis Rheum., 15: 23–35.
• 8. Cozzani E., Drosera M., Gasparini G., Parodi A. (2011) Serology of lupus erythematosus: correlation between immunopathological features and clinical aspects. Autoimmune Dis., 2014: 321–359.
• 9. Meda F., Folci М., Baccarelli А. (2011) The epigenetics of autoimmunity. Cell. Mol. Immunol., 8: 226–236.
• 10. Migliorini S., Baldini C., Rocchi V., Bombardieri S. (2005) Anti-Sm та anti-RNP antibodies. Autoimmunity, 38: 47–54.
• 11. Novak G.V., Marques M., Balbi V. (2017) Anti-RO/SSA and anti-La/SSB antibodies: Association with mild lupus manifestations in 645 childhood-onset systemic lupus erythematosus. Autoimmun. Rev., 16: 132–135.
• 12. Sawalha A.H., Harley J.B. (2004) Antinuclear antibody in systemic lupus erythematosus. Curr. Opin. Rheumatol., 16: 534–540.
• 13. Yang H.O., Zhang XQ Fu Q.H. (2016) Evaluating anti-SmD1-amino-acid 83–119 peptide reactivity in children with systemic lupus erythematosus and other immunological diseases. Chin. Med. J. (Engl.), 129: 2840–2844.

Адреса для листування:
Толстяк Ярослав Федорович
79000, Львів, вул. Пекарська, 68
Львівський національний медичний
університет імені Данила Галицького
E-mail: tolstyakyaroslav@gmail.com

No Comments » Додати свій

Leave a comment

Name (required)

Mail (will not be published) (required)

Website

Введите цифры, изображенные на картинке *