ПОЛІМОРФІЗМ ГЕНІВ ВРОДЖЕНОГО ІМУНІТЕТУ ТА ОСОБЛИВОСТІ ВІТАМІН D-СТАТУСУ ПРИ ЮВЕНІЛЬНОМУ ІДІОПАТИЧНОМУ АРТРИТІ

УДК 616.72-002:616-097+612.017.1

DOI: 10.32471/rheumatology.2707-6970.83.16038

Ювенільний ідіопатичний артрит (ЮІА) — гетерогенна група запальних артритів невідомої етіології з початком хвороби до 16 років і мінімальною тривалістю 6 тиж після виключення інших відомих причин синовіїту (ACR, 2019).

На сьогодні доведено, що до генетичних факторів, з якими асоціюється розвиток ЮІА, відносять наявність певних алелів генів у локусах HLA-DRB1, HLA-В27, HLA-В7, PTPN2 та ін. Однак природа поєднань цих генів з формуванням аутоімунного процесу залишається неясною (Frisell T. et al, 2016). Імовірно, що алелі генів HLA здатні впливати на пенетрантність основних генів захворювання, значно підвищуючи її, що й пояснює високу частоту «загальних епітопів» серед хворих. Однак під час оцінки кількісного внеску HLA-локусу в схильність до ЮІА визначено, що частка HLA-комплексу в загальній генетичній компоненті захворювання становить лише 30–37,0% (Hollenbach J.A. et al., 2010), тому пошук кандидатних генів постійно розширяється.

В останні роки ЮІА, як і більшість інших аутоімунних хвороб, розглядається як захворювання, що має полігенний тип наслідування. Загальногеномні дослідження GWAS у пацієнтів з ревматоїдним артритом виявили 377 генів-кандидатів в 100 локусах ризику, які регулюють численні ланки імунозапальних процесів, включаючи каспазу-8, каспазу-10, аутоімунний регулятор (autoimmune regulator — AIRE), рецептор інтерлейкіну (IL)-2α (CD25), тирозин-протеінфосфатазу C рецепторного типу (CD45), білок 1, що активує рекомбінацію VDJ (RAG1), RAG2, CD40, серин-протеїнкіназу АТМ, нерецепторний тирозин-протеїнкіназу TYK2, рецептор інтерферону-γ 2-го типу (IFN-γ 2) і регуляторний фактор інтерферону 8 (IRF8), транскрипційний ядерний фактор (NF)-kB, толл-подібний рецептор 4 (TLR4) та ін. (Ciccarelli F. еt al., 2014).

На даний час зусилля вчених спрямовані на пошуки інших генів, які детермінують схильність до ЮІА. І в цьому плані ЮІА як аутоімунне захворювання, яке спричиняє дефекти адаптивного імунітету із втратою толерантності до аутоантигенів, має загальні клінічні прояви і ​​перехресний зв’язок з аутозапальними синдромами, які характеризуються епізодичними запаленнями через невідповідну активацію вродженої імунної відповіді (Ciccarelli F. et al., 2014). Обидва типи станів призводять до системного запалення за відсутності відомого тригера і передбачають істотне перекриття обох імунних шляхів (Arakelyan A. et al., 2017).

Разом з тим існують докази того, що в реалізації захворювання у кожного окремого індивідуума відіграють роль не лише генетичні чинники, а й фактори середовища, серед яких забезпеченість організму вітаміном D. Результати проведених нами за останні роки досліджень свідчать про зниження рівня 25OHD в сироватці крові у дітей з високою активністю та тяжким перебігом ЮІА. Враховуючи імунорегуляторні функції цього вітаміну, це може спричиняти розвиток аутоімунного процесу в організмі (Плехова Н.Г., Каблуков Д.А., 2018).

Генетичні дослідження свідчать, що більшість кандидатних генів ЮІА, залучених у процеси імунної регуляції, знаходяться всередині або поблизу генів, які контролюють складний метаболізм вітаміну D. Функціональні аспекти таких генетичних асоціацій можуть бути пояснені втратою або посиленням функцій в асоційованому з вітаміном D гені, і, як наслідок, змінами регуляції експресії генів у певних типах імунних клітин (Lu M. et al., 2018).

Використання сучасних методів секвенування геному дозволило визначити, що зв’язок між вітаміном D та ЮІА може базуватися на широкому та характерно геномному зв’язуванні рецептора вітаміну D (Lu M et al, 2018).

Вплив вітаміну D і його активного метаболіту — альфакальцидіолу — на перебіг ЮІА та виявлена кореляція між концентрацією в сироватці крові 25OHD та активністю, тяжкістю клінічного перебігу і прогнозом хвороби визначає важливі для регуляції імунної системи функції вітаміну D, що, зокрема, сприяють зменшенню запального профілю цитокінів та співвідношення (Treg/Th17). Ефекти 1,25 (OH)₂D₃, ймовірно, — ключ до його потенційної здатності обме­жити аутоімунітет через зниження активації, проліферації та регуляції функції Т-клітин (Lu M et al, 2018).

В організмі людини рецептор до кальційтріолу (VDR) кодується геном, локалізованим у 12-й хромосомі (12q13), специфічний поліморфізм якого визначає різні біологічні реакції на вітамін D (McAllister K. et al., 2011). Ген VDR складається з 11 екзонів і дотепер виявлено 510 його генетичних варіацій.

Рецептор вітаміну D (або NR1I1) належить до сімейства ядерних транскрипційних білків і бере участь не тільки в процесі транскрипції, а й у механізмах посттранскрипції, контрольованих мікро-РНК (McAllister K. et al, 2011). Регульована ендокринними, аутокринними і паракринними механізмами, гормональна форма вітаміну D (1,25(OH)₂D) для реалізації свого ефекту має бути пов’язана зі специфічним VDR, щоб надавати епігенетичні та генетичні ефекти, діючи як зв’язок між позаклітинними подразниками та геномною відповіддю клітин.

1,25-дигідроксивітамін D (1,25(OH)₂D) відіграє свою роль у функціонуванні клітин-мішеней після зв’язування з кінцевим фрагментом VDR у цитозолі, який наявний майже в усіх тканинах та імунних клітинах. Отриманий комплекс «рецептор — гормон» переходить в ядро і зв’язується з елементом відповіді на вітамін D (VDRE) в промоторі гена.

Поява загальнодоступних підходів до профілювання експресії генів призвела до ідентифікації численних генів, регульованих VDR. Описані дані про експресію рецепторів вітаміну D дендритними клітинами, макрофагами, синовіоцитами, хондроцитами, епітеліоцитами, що визначає ключовий ефект вітаміну D в регуляції вродженого імунітету. Вітамін D в дендритних клітинах змінює їх метаболічний профіль, сприяє продукції толерогенного фенотипу і посиленню секреції інтерлейкіну-10 та підвищенню рівня Treg (Mailhot G. et al., 2020).

Згідно із сучасними даними, виявлення поліморфізмів генів вродженого імунітету дає можливість підвищити ефективність діагностики, прогнозування та оцінки реакції організму на лікування ювенільних артритів. Крім очевидного впливу дефіциту вітаміну D на перебіг та прогноз захворювання, важливого значення набувають генетичні аспекти контролю над метаболізмом і станом імунної відповіді організму на дію різних факторів середовища.

Мета. Дослідити взаємозалежність між змінами нуклеотидної послідовності в генах вродженого імунітету та рівнем забезпеченості організму вітаміном D при ідіопатичних артритах у дітей.

Матеріали та методи

Дослідження проведені у 33 дітей з діагнозом ЮІА віком 1–17 років (16 хлопчиків, 17 дівчат), які спостерігалися у ДУ «Інститут педіатрії, акушерства та гінекології ім. академіка О.М. Лук’янової Національної академії медичних наук України». Діагноз ЮІА встановлено згідно з критеріями Все­світньої ліги ревматологічних асоціацій (International League of Associations for Rheumatology — ILAR) (Mailhot G. et al., 2020).

Пацієнти були стратифіковані за клінічними субтипами ЮІА: з олігоартритом — 15 (45,4%) хворих, у тому числі позитивні за HLA-B27-антигеном (ЮІА ентезит-асоційований, HLA-В27-позитивний) — 8 (24,2%) та переднім увеїтом (ЮІА-увеїт) — 2 (6,0%); поліартритом — 10 (30,3%); системним — 8 (24,2%) дітей. Середня тривалість хвороби становила 4,3±3,3 року (табл. 1).

У дебюті захворювання у 19 (57,5%) дітей відмічали підвищені гострофазові показники (активність II ступеня); позитивними за АНФ (+) були 18 (54,5%) дітей, у 3 (9,0%) діагностовано селективний імунодефіцит IgA. Усі діти були серонегативними за ревматоїдним фактором (РФ) та не мали антитіл до цитрулінового віментину (А-ССР).

Поряд із загальноприйнятими методами обстеження згідно з уніфікованим клінічним протоколом медичної допомоги дітям, хворим на ювенільний артрит, рекомендованим МОЗ України, всім дітям проведено оцінку вітамін D-статусу, за показниками 25 -гідроксивітаміну D (25OHD) в сироватці крові.

Концентрацію 25ОНD визначали з використанням імуноферментного набору для кількісного визначення 25-гідроксивітаміну D та інших гідроксильованих метаболітів у сироватці або плазмі на імуноферментному фотоелектричному аналізаторі Рідер ER 500 № ER2J018E.

Оцінювали статус вітаміну D за останньою класифікацією, згідно з якою дефіцит вітаміну D встановлюється за концентрації 25ОНD нижче 50 нмоль/л (20 нг/мл), недостатність вітаміну D — при показниках 25ОНD між 75 нмоль/л (30 нг/мл) та 50 нмоль/л (20 нг/мл). Концентрація 25ОНD 75 нмоль/л (30 нг/мл) і вище вважалася в межах норми (Ringold S. еt al., 2019) і (Endocrine Society Task Force, 2011).

У всіх пацієнтів з ЮІА проведено панельне секвенування 207 генів, що регулюють імунні функції. Виконано забір злущеного епітелію ротової порожнини у пробірку Saliva Collection Kit Oragene^TM згідно з інструкцією. Високопродуктивне панельне екзомне секвенування (next generation sequencing — NGS) нового покоління, яке базується на розшифровці фрагментів молекули ДНК, проводилося на апараті Illumina’s HiSeq (виробництва США) в лабораторії Invitae (США), кожна зміна нуклеотидної послідовності секвенувалася за Сегнером. Генетичні зміни перевірені та розшифровані в генетичній базі даних ExAC.

Результати, що взяті для наукового дослідження, відповідають нормам біоетики та деонтології.

Отримані цифрові дані опрацьовані статистично за допомогою комп’ютерного пакету програм Microsoft Excel. Достовірність різниць оцінювали за допомогою t-критерію Ст’юдента. Різницю між порівнюваними величинами вважали достовірною при р<0,05. Використовували статистичний показник відношення шансів (ВШ), який дозволяє оцінити зв’язок між певним результатом і фактором ризику та порівняти групи досліджуваних за частотою виявлення певного фактору ризику.

Отримані результати та їх обговорення

Під час проведення секвенування генів у всіх дітей з ЮІА виявлені зміни нуклеотидної послідовності в генах, які асоціюються з порушеннями імунної регуляції, з них у 13,2% пацієнтів мутації розцінені як патогенні (IL7R, RMRP, TREX1, SP110, MUTYH, WFS1). Поліморфізм генів, які асоціюються з аутозапальними синдромами, встановлено у 63,63% дітей: NOD2, ADA2, ELANE, MEFV, NLRP12, PSTPIP1, LPIN2 (табл. 2). При цьому, одна дитина могла мати зміни нуклеотидної послідовності в 2–3 генах цієї групи, з найбільшою частотою (75,0%) — у дітей із системним ЮІА.

У всіх дітей, у яких відмічали поліморфізм генів, асоційованих з аутозапальним синдромом, базисна хворобомодифікуюча терапія не дозволила отримати стійкої стабілізації патологічного процесу, що проявлялося в повільному його прогресуванні. Ці пацієнти мали обтяжений анамнез (ауто­імунні хвороби у родичів першого споріднення, завмерлі вагітності), часті бактеріальні та/або вірусні інфекції протягом життя. У всіх дітей в дебюті хвороби констатовані бактеріальні (Campylobacter, Citrobacter, Escherichia, Helicobacter, Pseudomonas, Staphylococcus, Yersinia) та часті вірусні інфекції. Терапія нестероїдними протизапальними препаратами у всіх цих дітей була малоефективна, а позитивну терапевтичну відповідь отримано при посиленні протизапальної дії за рахунок глюкортикоїдів та/або біологічної терапії.

У окремих хворих виявлено зміни нуклеотидної послідовності, що на даний момент не достатньо описані в базах даних і продовжують вивчатися: ATM, RTEL1, CASP10, CARD11, JAK3, IL21R, IL10RA, STAT3, NFKB2, IRAK4, IRF8.

Зниження концентрацій вітаміну D виявлено у 31 (93,9%) дитини з ЮІА, з них у 3 — виражений дефіцит. Усі діти з олігоартритом мали знижену забезпеченість вітаміном D, проте найбільш низькі концентрації вітаміну D відмічали у дітей з поліартикулярним (25,22±0,97) нг/мл) субтипом ЮІА, р≤0,05 (табл. 3).

У 6 (18,1%) дітей виявлено зміни нуклеотидної послідовності у гені NOD2: c.2104C>T (p.Arg702Trp), c.3019dupC (p.Leu1007Profs*2), з яких у 2 дітей з системним ЮІА та 4 — з олігоартритом. Мутації гена NOD2 класично асоціюються з підвищеним ризиком розвитку хвороби Крона (Ringold S., 2019), аутосомно-домінантним синдромом Блау (MedGen UID: 348835). Найбільш поширені варіативні зміни NOD2: c.2104C>T (p.Arg702Trp), c.2722G> C (p.Gly908Arg) та c.3019dupC (p.Leu1007Profs*2). Слід зазначити, що жоден із наших пацієнтів на момент обстеження не мав ознак запального захворювання кишечнику та у всіх відмічали нормальні концентрації кальпротектину.

Поліморфізм гену NOD2 існує у 1–3% населення, що підвищує в 2–4 рази ризик клінічної маніфестації при гетерозиготному та в 7–9 разів — при гомозиготному стані (ExAC database). Виявлення майже у 20,0% пацієнтів з ЮІА варіативних змін визначає статистично вірогідну різницю з популяційною частотою (ВШ 11,395; 95% довірчий інтервал (ДІ) 2,395–54,22).

У всіх дітей з мутаціями в гені NOD2 встановлені знижені концентрації вітаміну D — 17,2±3,29 нг/мл, з них у 3 — дефіцит у межах 14,78–16,53 нг/мл, а у дітей без змін нуклеотидної послідовності — лише у 23 (85,1%) дітей (ВШ= 0,097; ДІ 0,030–0,307). Отримані дані свідчать, що у дітей з відсутністю змін нуклеотидної послідовності в гені NOD2 концентрація ВD була достовірно вищою — 26,68±2,34 нг/мл, p=0,026 (табл. 4).

Виходячи з того, що останні дослідження пов’язують ефекти вітаміну D з антибактеріальною активністю в моноцитах, важлива особливість цього нового погляду на вітамін D та імунологію полягає у здатності моноцитарних рецепторів розпізнавати патогени (PRR) і запускати локальний метаболізм попередника вітаміну D, 25-гідроксівітаміну D (25OHD). Синтез 1,25 (OH)₂D достатній для стимуляції внутрішньоклітинної активації відповіді VDR і супутньої індукції вродженого імунітету. Беручи до уваги той факт, що 25OHD є основною циркулюючою формою вітаміну D, ці спостереження продемонстрували чіткий потенційний зв’язок між статусом вітаміну D та ефективністю імунної відповіді. Активація та передача сигналів від PRR призводить до продукції антимікробних пептидів, цитокінів та хемокінів, які поширюють сигнал до інших компонентів імунної системи. Дослідження 1,25 (OH)₂D-регульованої експресії генів у клітинах, які відповідають за функцію вродженого імунітету, показали, що сигналізація вітаміну D функціонує сильніше (активніше) за PRR для посилення імунної відповіді, індукції експресії CD14, кофактора TLK4 PRR, а також NOD2 (нуклеотид-зв’язуючий білок домену олігомеризації) (Mailhot G., White J.H., 2020).

У разі збільшення експресії білка NOD2 мононуклеарні клітини підвищують синтез фактора некрозу пухлини α (tumor necrosis factor α — TNFα), IL-8 та IL-1β, а при його зниженні — зменшуються концентрації прозапальних цитокінів, NF-KB, фактор F6, асоційованого з рецептором фактора некрозу пухлини (TNF receptor-associated factor 6 — TRAF6) та IκB кіназою (IκB kinase — IKK), що визначає роль NOD2 в регуляції аутоімунного процесу. Ген VDR, зв’язаний з вітамін D-гормонами 1,25(OH)₂D₃, також безпосередньо стимулює транскрипцію генів, що кодують антимікробні пептиди, кателіцидин, антимікробний пептид (CAMP/LL37) та β-дефензин 2 людини, дефенсин B₄ (HBD₂/DEFB₄) (Yazdanyar S. et al., 2009; Wang T., 2010). Сигналізація вітаміну D також бере участь у регуляції як вродженого, так і адаптивного імунітету, зменшуючи запальну відповідь дендритних клітин (Mailhot G., White J.H., 2020), що сприяє пригніченню 1,25(OH)₂D-запальних реакцій периферійних Т-клітин та посиленому синтезу Т-регуляторних (Treg) клітин (Mailhot G. et al, 2020; Dimitrov V. et al., 2016). Загальногеномний аналіз передачі сигналів вітаміну D показав, що VDR регулює транскрипцію і багатьох інших генів, залучених до функціонування імунної системи, таких як NOD2, Nf-kB, Il-1,2,6 (Urry Z. et al, 2012).

Отже, отримані дані підтверджують, що організм фізіологічно здатний до продукування 1,25(OH)₂D локально в клітинах вродженого імунітету у відповідь на патогени, а передача сигналів вітаміну D є ключовим компонентом багатьох аспектів імунорегуляторних процесів.

Висновки

1. Виявлення у 18,1% пацієнтів з ЮІА варіативних змін у гені NOD2 визначає статистично вірогідну різницю з популяційною частотою (ВШ 11,395, ДІ 2,395–54,22).

2. У всіх дітей з мутаціями в гені NOD2 встановлені знижені концентрації вітаміну D, з них у половини — його дефіцит, що статистично достовірно порівняно з 85,1% дітей без змін нуклеотидної послідовності у цьому гені (ВШ 0,097; ДІ 0,030–0,307). У дітей з відсутністю змін нуклеотидної послідовності в гені NOD2 концентрація 25OHD в сироватці крові була достовірно вищою, p=0,026.

3. Проведення генетичного секвенування та виявлення нових мутацій у генах, які асоціюються з порушенням функцій вродженого імунітету, дозволяє розширити уявлення про патогенетичні особливості ЮІА і його клінічних варіантів субтипів. Продовження дослідження, яке включатиме нові дані генетичного скринінгу потенційно може продемонструвати зв’язок між змінами в геномах при ЮІА із впливом поліморфізмів рецептора вітаміну D та уточнити механізми зв’язку між вітаміном D та функціональним станом імунних клітин. Постають нові питання щодо впливу гена VDR, його генотипів і алелів ризику на процеси диференціації імунних клітин і їх ролі при різних клінічних формах ЮІА.

Список використаної літератури

• 1. Плехова Н.Г., Каблуков Д.А.(2018) Полиморфизм гена рецептора витамина D и регулирующие гормоны минерального обмена в оценке состояния костной системы у подростков приморского края. Современные проблемы науки и образования, 4, 616.71–007.1–053(571.63).
• 2. Arakelyan A., Nersisyan L., Poghosyan D. et al. (2017) Autoimmunity and autoinflammation: A systems view on signaling pathway dysregulation profiles. PLoS One. 3;12(11):e0187572.
• 3. American College of Rheumatology, Arthritis Care & Research (2019) 703–716.
• 4. Ciccarelli F., De Martinis M., Ginaldi L. (2014) An update on autoinflammatory diseases. Curr Med Chem., 21(3): 261–9.
• 5. Consensus vitamin D position statement, online: http://www.sunsmart.org.uk/prod_consump/groups/cr_common/@nre/@sun /documents/generalcont ent/cr_052628.pdf.
• 6. Dimitrov V., White J.H. (2016) Species-specific regulation of innate immunity by vitamin D signaling. J. Steroid Biochem Mol. Biol., 164: 246–253.
• 7. Endocrine Society Task Force (2011) Evolution, treatment, and prevention of vitamin D deficiency, online: http://www.endo-society.org/guidelines /final/upload/final-standalone-vitamin-dguideline.pdf.
• 8. ExAC database. https://gnomad.broadinstitute.org/variant/16–50745926-C-T?dataset = gnomad_r2_1.
• 9. Frisell T., Saevarsdottir S., Askling J. (2016)_ Family history of rheumatoid arthritis: an old concept with new developments. Nat Rev Rheumatol, 12(6): 335–e43.].
• 10. Hollenbach J.A., Teodorica L., Bugawan M.S. (2010) Juvenile idiopathic arthritis and HLA class i and class ii interaction and age of onset effects, Arthritis Rheum., 62(6): 1781–1791.
• 11. McAllister K., Eyre S., Orozco G. (2011): Genetics of rheumatoid arthritis: GWAS and beyond Open Access Rheumatol, 3: 31–46.
• 12. Mailhot G., White J.H. (2020) Vitamin D and Immunity in Infants and Children. Nutrients, 12(5): 1233.
• 13. Ming L., Bruce V.T., Körner H. (2018) Genomic Effects of the Vitamin D Receptor: Potentially the Link between Vitamin D, Immune Cells, and Multiple Sclerosis, 9: 477.
• 14. Ringold S., Sheila T., Han A., Beukelman T. (2019) American College of Rheumatology/Arthritis Foundation: Guideline for the Treatment of Juvenile Idiopathic Arthritis: Therapeutic Approaches for Non
• -Systemic Polyarthritis, Sacroiliitis, and Enthesitis, Arthritis Care Res (Hoboken), 71(6): 717–734.
• 15. Urry Z., Chambers E.S., Xystrakis E. et al.(2012) The role of 1, 25-dihydroxyvitamin D3 and cytokines in the promotion of distinct Foxp3+ and IL-10+CD4+ T cells. Eur. J. Immunol., 42: 2697–2708.
• 16. Wang T.-T., Dabbas B., Laperriere D. et al.(2010) Direct and Indirect Induction by 1, 25-Dihydroxyvitamin D3 of the NOD2/CARD15-Defensin β2 Innate Immune Pathway Defective in Crohn Disease. J. Biol. Chem., 285: 2227–2231.
• 17. Yazdanyar S., Weischer M., Nordestgaard B.G. (2009) Genotyping for NOD2 genetic variants and crohn disease: a metaanalysis. Clin Chem., 55(11): 1950–7.

Адреса для листування:
Муквіч Олена Миколаївна
Київ, вул. П. Майбороди, 8
ДУ «Інститут педіатрії, акушерства та гінекології
ім. академіка О.М. Лук’янової НАМН України»

No Comments » Додати свій

Leave a comment

Name (required)

Mail (will not be published) (required)

Website

Введите цифры, изображенные на картинке *